蛋白磷酸化指蛋白质肽链上特定氨基酸共价结合磷酸基团的过程，结合磷酸基团的氨基酸的种类以及其处于多肽链中的位置就称为磷酸化位点。真核生物的磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等氨基酸残基上，而原核生物磷酸化主要发生在组氨酸、精氨酸和赖氨酸等残基上。
利用液相色谱串联质谱技术LC-MS-MS鉴定磷酸化位点需要先鉴定发生磷酸化的肽段，在此基础上进行磷酸化位点分析。基于LC-MS-MS的磷酸化位点鉴定中，利用蛋白酶将蛋白质样品消化成小片段肽段，由于正常生理条件下磷酸化水平较低，磷酸化肽段丰度也较低，为了提高实验的灵敏度和准确性，通常需要对磷酸化的肽段进行富集再进行液相色谱串联质谱分析。串联质谱会测量完整的肽质量和碎片离子质量，通过分析肽段分子质量是否增加了磷酸酯基团的质量数来判定该肽段磷酸化与否。在某些情况下检测到的磷酸化肽段只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，那么这个氨基酸位点即是磷酸化位点，当检测到的磷酸化肽段含有多个氨基酸残基时，则需要进行二级质谱进一步确定磷酸化的氨基酸位点。
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